اثر چند شکلی های ژن GH بر صفات رشد در ماهی سفید دریای خزر (Rutilus kutum) و کپور معمولی (Cyprinus carpio) به روش PCR-SSCP
 اثر چند شکلی های ژن GH بر صفات رشد در ماهی سفید دریای خزر (Rutilus kutum) و کپور معمولی (Cyprinus carpio) به روش PCR-SSCP
چکیده هورمون رشد (GH) مهم‌ترین هورمون کنترل کننده رشد سلول‌های سوماتیک و موثر در سنتز پروتئین، چربی و کربوهیدرات‌ها می‌باشد. هدف از پژوهش حاضر شناسایی چند شکلی‌های ژن GH-1در ماهی کپور معمولی و GH-2 در ماهی سفید با استفاده از تکنیک PCR-SSCP و ارتباط آن با صفات مرتبط به رشد (فاکتور وضعیت، طول و وزن بدن) بوده است. تعداد 150 قطعه ماهی کپور در 4 گروه سنی 4، 6، 12و 24 ماهه و 150 قطعه ماهی سفید در سن 3 ماهگی به طور تصادفی انتخاب و از باله دمی برای استخراج DNA استفاده شد. پس از استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته، دو قطعه به اندازه 373 و 410 جفت باز به ترتیب برای جایگاه‌های ژنی GH-1در ماهی کپور معمولی و GH-2 در ماهی سفید تکثیر و تعیین ژنوتیپ افراد به روش SSCPانجام گرفت. در نمونه‌های مورد مطالعه 8 الگوی باندی متفاوت A، B، C، D، E، F، G و H در جمعیت کپور ماهیان بهترتیببافراوانی‌های 33/31، 67/10، 67/20، 67/22، 4، 2، 67/2 و 6 درصد و 3 الگوی باندی متفاوت A، B و C به ترتیب با فراوانی 67/24، 67/58 و 67/16 درصد در جمعیت ماهی سفید مشاهده شد. تجزیه و تحلیل نشانگر- صفت ارتباط معنی دار آماری بین ژنوتیپ های مختلف ژن GH-2 ماهی سفید با صفات وزن، طول بدن و فاکتور وضعیت وجود ندارد. همچنین بین ژن GH-1 ماهی کپور در سه گروه سنی 4 ماه، 6 ماه و 12 ماه با صفت وزن ارتباط معنی دار آماری (05/0>P) وجود دارد در حالی که با صفات طول و فاکتور وضعیت ارتباط معنی داری مشاهده نشد. آزمون چند دامنه‌ای دانکن برای جمعیت ماهیان کپور معمولی در سه گروه سنی 4 ماه، 6 ماه و 12 ماه نشان داد که ماهیان با ژنوتیپ دارای الگوی باندی D به طور معنی داری (05/0>P) دارای وزن بیشتری نسبت به سایر ژنوتیپ ها بودند. همچنین آزمون چند دامنه‌ای دانکن برای ماهی سفید نشان داد که افراد با ژنوتیپ C،CF بالاتری (05/0>P) نسبت به افراد با ژنوتیپ A داشتند. از نظر صفات وزن و طول در داخل جمعیت ماهیان سفید، هیچ کدام از ژنوتیپ ها با یکدیگر اختلاف معنی دار نداشتند. نتایج تعیین توالی قطعه تکثیری در ماهی سفید نشان داد که در الگوی باندیC، نه SNP به صورت تغییرنوکلوتیدیT به G در موقعیت 82 جفت بازی، A به C در موقعیت 113 جفت بازی، G به A در موقعیت 207 جفت بازی، G به A در موقعیت 254 جفت بازی، G به A در موقعیت 269 جفت بازی، G به A در موقعیت 296 جفت بازی، A به G در موقعیت 307 جفت بازی، C به A در موقعیت 308 جفت بازی و G به A در موقعیت 346 جفت بازی رخ داده است. همچنین در موقعیت 366 جفت بازی در الگوی باندی B یک جهش از نوع حذف مشاهده شد. مشاهده هشت الگوی باندی مختلف در جایگاه مورد مطالعه در این پژوهش نشان دهنده تنوع زیاد در جایگاه ژنی GH-1 در جمعیت ماهیان کپور معمولی می‌باشد. بنابراین با توجه به اهمیت اقتصادی ماهی کپور معمولی و ماهی سفید در صنعت پرورش و وجود همبستگی بین چندشکلی‌های مشاهده شده و صفات رشد احتمالا بتوان از این جایگاه نشانگری در برنامه‌های اصلاح ن‌ژادی در جمعیت‌های مورد مطالعه بهره برد. به هر حال جهت دست یابی به نتایج مطمئن نیاز به تکرار آزمون با تعداد نشانگر بیشتر از این جایگاه‌های ژنی و اندازه نمونه‌های بزرگ‌تر از این جمعیت‌ها می‌باشد.
کلمات کلیدی: ژن GH، کپور معمولی، ماهی سفید، PCR-SSCP
شماره صفحه عنوان 1-2 ژن‌های کاندیدا و اهمیت آن‌ها4 2-1 مروری کوتاه بر خصوصیات بیولوژیکی و زیستگاهی ماهیان مورد مطالعه6 2-5-4 اثرات متابولیکی هورمون رشد12 2-5-4-1 افزایش سرعت پروتئین سازی در بیشتر سلول‌های بدن12 2-5-4-2 افزایش رونویسی هسته‌ای DNA برای ساخت RNA13 2-5-4-3 افزایش میزان چربی‌ها برای تولید انرژی13 2-5-4-4 کاهش مصرف کربوهیدرات‌ها13 2-7-5 نشانگرهای DNA یا نشانگرهای مولکولی16 2-8 نشانگرهای DNA مبتنی بر واکنش زنجیره‌ای پلیمراز16 2-9 واکنش رنجیره ای پلیمراز (PCR)17 2-9-3 دی اکسی نوکلئوتیدها (dNTPs)18 2-10 چند شکلی فضایی رشته‌های منفردSSCP) )19 2-11 مروری بر برخی پژوهش‌های انجام شده:20 3-3 استخراج DNA به روش نمکی بهینه یافته23 3-3-1 طرز تهیه بافرهای استخراج DNA23 3-4 تعیین ویژگی‌های کمی و کیفی DNA استخراج شده:24 3-5 تعیین غلظت DNA استخراج شده با استفاده از اسپکتوفتومتر26 3-6 واکنش زنجیره‌ای پلیمراز (PCR)26 3-6-1 پروتکل و مواد استفاده شده در PCR26 3-6-3 تنظیم سیکل‌های حرارتی PCR28 3-6-3-1 واسرشته سازی قطعه الگو28 3-6-3-3 بسط(طویل سازی) آغازگرها:28 3-7 چندشکلی فضایی در تک رشته DNA (SSCP)29 3-8 الکتروفورز محصولات SSCP روی ژلاکریلآمید30 3-8-1 تهیه ژل پلی اکریل آمید30 3-8-2 آماده سازی دستگاه الکتروفورز عمودی31 3-8-3 رنگ آمیزی با نیترات نقره32 3-8-3-1 مراحل انجام رنگ آمیزی نیترات نقره:32 3-10 تعیین توالی الگوهای باندی مشاهده شده در جمعیت مورد مطالعه34 3-11-1 تجزیه و تحلیل آماری ژنتیک جمعیت و ارتباط نشانگر- صفت34 3-11-2 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک توالی‌های به دست آمده35 4-1 بررسی کمیت و کیفیت DNA استخراج شده37 4-2-2 ژن GH-1 ماهی کپور معمولی38 4-3 الگوهای باندی مشاهده شده جایگاه GH38 4-3-1-1 بررسی فاکتور وضعیت ماهی سفید39 4-3-1-2 بررسی ارتباط بین نشانگر- صفت در جایگاه GH-2 ماهی سفید39 4-3-2 ژن GH-1 ماهی کپور معمولی40 4-3-2-1 بررسی فاکتور وضعیت کپور معمولی41 4-3-2-2 بررسی ارتباط بین نشانگر- صفت در جایگاه GH-1 ماهی کپور معمولی41 4-5 تجزیه و تحلیل بیوانفورماتیک42 4-5-2 مقایسه توالی GH-2 ماهی سفید و ماهی کپور معمولی43 4-6 تعیین ژنوتیپ الگوهای باندی جایگاه GH-2 ماهی سفیدپس از توالی‌یابی47 4-7 برآورد مقدار وفور ژنی و ژنوتیپی جایگاه GH-2 ماهی سفید48
فهرست اشکال و جداول و نمودارها شماره صفحه عنوان شکل 3-1 دستگاه الکتروفورز افقی25 جدول 3-1 اجزای تشکیل دهنده بافر بارگذاری26 جدول 3-2 مواد استفاده شده در واکنش زنجیره‌ای پلیمراز27 جدول 3-3 توالی آغازگر اختصاصی برای جایگاه GH28 جدول 3-4 دماهای استفاده شده در سیکل‌های PCR (درجه سانتی‌گراد)29 جدول 3-5 زمان‌ها و تعداد سیکل‌های استفاده شده در PCR29 جدول 3-6 مواد لازم جهت تهیه بافر بارگیری SSCP30 جدول 3-7 مواد لازم برای تهیه 65 میلی لیتر ژل اکریل آمید31 جدول 3- 8 مواد لازم جهت تهیه محلول ثابت کننده32 جدول 3-9 مواد لازم جهت تهیه محلول رنگ‌آمیزی32 جدول 3-10 مواد لازم جهت تهیه محلول ظاهرسازی33 شکل 4-1 نمونه‌های از DNA استخراج شده به روش نمکیبهینه یافته37 شکل 4-2 محصولات PCR یک قطعه از ناحیه اگزون 4، اینترون 4 و اگزون 5 برای ژن GH-2 در ماهی سفید37 شکل 4-3 محصولات PCR یک قطعه از ناحیه اگزون 4، اینترون 4 و اگزون 5 برای ژن GH-2 در ماهی کپور معمولی38 شکل 4-4 نمونه‌ای از باندهای SSCP ژن GH-2 ماهی سفید38 جدول 4-1 فراوانی الگوهای باندی مشاهده شده در نمونه‌های مطالعه شده39 جدول 4-2 بررسی فاکتور وضعیت ژنوتیپ های مشاهده شده در ماهی سفید39 جدول 4-3 جدول ANOVA و آنالیز آماری GLM برای ماهی سفید39 جدول 4-4 نتایج مقایسه میانگین حداقل مربعات الگوهای باندی مختلف برای صفت فاکتور وضعیت ماهی سفید40 شکل 4-5 هشت الگوی باندی مشاهده شده در جایگاه ژن GH-1 ماهی کپور معمولی40 جدول 4-5. فراوانی‌های ژنوتیپی جایگاه ژنی GH-1 مشاهده در 150 نمونه ماهی کپور مطالعه شده40 جدول 4-6 بررسی فاکتور وضعیت ژنوتیپ های مشاهده شده در ماهی کپور معمولی41 جدول 4-7 جدول ANOVA و آنالیز آماری GLM برای ماهی کپور معمولی41 شکل 4-6 مقابسه توالی‌ها بین نمونه‌های ماهی سفید با ژنوتیپ دارای الگوهای باندی A، B و C43 شکل 4-7 هم ترازی سه نمونه ارسال شده ماهی سفید برای توالی یابی.44 نمودار 4-1 نتایج حاصل از توالی‌یابی ماهی سفید47 نمودار 4-2 هتروزیگوتی الگوی باندی A و C.48 جدول 4-9 فراوانی ژنوتیپ‌های مشاهده شده و مورد انتظار در جایگاه GH-2 ماهی سفید48 جدول 4-10 فراوانی ژنوتیپی و آللی جایگاه GH-2 ماهی سفید49
روند رو به رشد جمعیت جهان و متعاقب آن افزایش نیازهای پروتئینی باعث شده است که بشر به مصرف آبزیان ازجمله ماهیان رو آورد. همچنین کاهش ذخایر آبزیان بشر را بر آن داشته تا برای پرورش گسترده آبزیان در محیط‌های آبی کوچک و محدود نیز اقدام کند. امروزه تقاضا برای مصرف ماهی در کلیه نقاط دنیا در حال افزایش است. به همین دلیل پیشرفت سریع در برنامه‌های تحقیقاتی به خصوص در زمینه تکثیر، پرورش، تغذیه، ژنتیک و مدیریت سیستم‌های پرورشی مورد نیاز خواهد بود. تقاضای جهانی برای مصرف ماهی و فرآورده‌های دریایی تحت تاثیر سه عامل افزایش جمعیت، میزان درآمد و قیمت آن است. پیش بینی شده است که تا چند سال آینده تقاضای جهانی برای مصرف ماهی و فرآورده‌های دریایی به بیش از 100 میلیون تن برسد (فائو، 2008). برای بهره برداری بیشتر از سیستم‌های تولید باید به دنبال راهکارهایی از قبیل اصلاح نژاد، بهبود تغذیه و یا مدیریت صحیح پرورش باشیم. در این بین اصلاح نژاد که به منظور تغییر ظرفیت ژنتیکی برای صفات اقتصادی مورد نظر انجام می‌گیرد، از اهمیت ویژه‌ای برخوردار است. صفات مختلف یک حیوان را می‌توان از نظر تعداد ژن‌های کنترل کننده و میزان تاثیر عوامل محیطی به دو دسته صفات کمی و کیفی تقسیم بندی کرد. صفات کیفی توسط یک یا تعداد کمی ژن بیان می‌شوند و عوامل محیطی در بروز این صفات اهمیت چندانی ندارند، ولی صفات کمی اغلب توسط تعداد زیادی ژن کنترل می‌شوند و در بروز آن‌ها عوامل محیطی موثر هستند. اغلب صفات کیفی وراثت پذیری بالایی دارند، در نتیجه انتخاب و اصلاح این صفات نسبتا آسان است و غالبا نیازی به انتخاب غیر مستقیم وجود ندارد. ولی صفات کمی که عوامل محیطی بر آن‌ها موثر است، فنوتیپ موجود ممکن است گویای ژنوتیپ صفات نباشد. برای رفع این مشکل تکنیک‌های پیشرفته اصلاح نژاد با استفاده از علم آمار تدوین شده است. این روش‌ها در چندین سال اخیر مفید بوده و پیشرفت‌های قابل توجه ای را موجب شده است (هرندی،1377). امروزه تکنیک ژنتیک مولکولی انقلابی در تجزیه ژنتیکی گونه‌های اهلی ایجاد کرده است. به طوری که بر اساس آن می‌توان چند شکلی را در سطح DNA [1]شناسایی و از آن به عنوان نشانگرهای مولکولی استفاده کرد و به مطالعه افراد و موجودات مختلف پرداخت (ولر و همکاران،1990). ماهی سفید[2] دریای خزر در بین ماهیان استخوانی یکی از گونه‌های با ارزش و اقتصادی در حوزه جنوبی این دریا می‌باشد که با توجه به لذیذ بودن، ارزش غذایی بالا و کیفیت عالی گوشت بیش از 50% کل صید این ماهیان را به خود اختصاص می‌دهد، به طوری که میزان صید آن در سال 1386 بالغ بر 17 هزار تن بود (قاسمی و همکاران 1386). در سه استان همجوار دریای خزر میزان صید ماهی سفید 63/59% از کل صید ماهیان این دریا را در سال 1390 به خود اختصاص داده است (معاونت صید استان‌های گلستان، مازندران، گیلان). دو نژاد بهاره و پاییزه ماهی سفید در دریای خزر وجود دارند که نژاد بهاره آن بیش از 98% ذخایر ماهی سفید دریای خزر را تشکیل می‌دهد. در سال‌های اخیر، ذخایر نژاد پاییزه ماهی سفید به علت از بین رفتن بسترهای طبیعی تخم ریزی، صید بی رویه و دیگر عوامل تاثیر گذار کاهش یافته است (قاسمی و همکاران 1386). ماهی کپور معمولی[3]از خانواده کپور ماهیان[4]، بومی آسیای مرکزی است که طی قرن‌های متمادی در نواحی مختلف جهان گسترش پیدا کرده است. دریای خزر زیستگاه مهمی برای کپور معمولی وحشی است که یکی از ماهیان اقتصادی و منبع غذایی مهمی محسوب می‌شود لذا سهم بزرگی در تقویت منبع این ماهی در دریا دارد (یوسفیان، 2011). هر چند این گونه به صورت بومی و طبیعی در تمام سواحل دریای خزر وجود دارد و برای تولید مثل وارد مصب رودخانه‌ها می‌شود، اما در سال‌های اخیر به دلیل صید بیش از حد و از بین رفتن محل‌های تولید مثل، نسل آن‌ها کاهش پیدا کرده است به طوری که جزو گونه‌های نیازمند به حفاظت در منطقه به شمار می‌رود (قلیچ پور و همکاران 1389). در حال حاضر، کاهش ذخایر آبزیان در اکثر نقاط دنیا توجه متخصصین را به اعمال روش‌های دقیق ازجمله روش‌های مولکولی جهت مدیریت ذخایر آبزیان جلب نموده است و شناسایی گونه‌ها و اصلاح نژاد آن‌ها در برنامه‌های بهره برداری از ذخایر آبزیان دریایی و آبزی پروری از اهمیت زیادی برخوردار است. علی رغم اهمیت این گونه‌ی با ارزش که در بین ساکنین حوضه جنوبی دریای خزر از اهمیت اقتصادی بالایی برخوردار است، مطالعات اندکی در زمینه ساختار ژنتیکی و جمعیت شناختی آن صورت گرفته است (قاسمی و همکاران 1386). هورمون رشد[5] (GH) نقش ضروری در تنظیم رشد، تقسیم سلولی، تمایز سلولی و بزرگ شدن اندازه سلول‌ها بازی می‌کند. اهمیتGH به عنوان یک عامل موثر در افزایش رشد از مدت‌ها پیش مشخص شده است.نشان داده شد که به کارگیری GH باعث افزایش میزان رشد در بیشتر حیوانات به خصوص ماهی می‌شود (سانسانسن و همکاران، 2009 و ژانگ و همکاران، 2014). همچنین نشان داده شد که GH رشد را به طور مستقیم از طریق افزایش سنتز DNA، پروتئین و لیپولیز در ماهیچه تحریک می‌کند. هورمون رشد از طریق تاثیر بر تولید و رها سازی یک میتوژن به نام I-IGF[6] که هم توسط کبد و هم بیشتر بافت‌های پیرامونی تولید می‌شود، به طور غیر مستقیم فرایند رشد را کنترل می‌کند (کلنگی میاندر و همکاران، 2013). جهش‌های موجود در نواحی مختلف ژن‌ها همواره مورد توجه بسیاری از متخصصان علم اصلاح نژاد می‌باشد. ارتباط چند شکلی این ژن‌ها با خصوصیات فنوتیپی به عنوان مثال رشد به طور وسیعی در دیگر حیوانات مورد بررسی قرار گرفته و مطالعات محدودی نیز در مورد ماهی انجام شده است (گروس و نیلسون، 1999 و تائو و بولدینگ، 2003). آنالیز قطعاتی از ساختار ژن هورمون رشد و گیرنده هورمون رشد[7] (GHR) در سطح سلول (چه کروموزوم و یا cDNA) اهمیت بنیادی و کاربردی دارد. ژن هورمون رشد و گیرنده آن را که از DNA هسته‌ای به دست آمده‌اند می‌توان برای مطالعه تکامل و ارتباط بین گونه‌ای و داخل گونه‌ای استفاده نمود. شناسایی تنوع آلل های ژن هورمون رشد در داخل گونه می‌تواند به انتخاب صفات رشد مطلوب در ماهی کمک شایانی نماید (کوخر و کهلمن، 2011). [8]SSCP روشی بر اساس رابطه بین تحرک الکتروفورزی تک رشته DNA و فرایند تاخوردن آن است که به نوبه خود، نشان دهنده توالی نوکلئوتیدها است. این روش، سریع و انجام آن آسان است. علاوه بر این، از آن‌جا که حتی تغییرات تک بازی در یک توالی به احتمال زیاد به رونوشت‌های مختلف می‌انجامد، گونه‌های بسیار نزدیک را حتی با استفاده از قطعات بسیار کوتاه می‌توان با دقت از هم جدا کرد (تلچا، 2009). نرخ شناسایی جهش‌های نقطه‌ای SSCP در سیستم‌های مختلف 90-80% است که برای شناسایی جهش‌ها روشی کارامد، مناسب و اقتصادی است (اکسین و جینگو، 2011). این روش تا به حال بر روی این ماهی‌ها انجام نشده است. به علاوه هنوز اساس مکانیزم ژنتیکی صفات مختلف در این گونه مشخص نشده است(اکسو و همکاران، 2012). 1-2 ژن‌های کاندیدا و اهمیت آن‌ها راهکار ژن‌های کاندید یکی از روش‌های بسیار قوی در بررسی ارتباط چندشکلی ژن با صفات اقتصادی مهم در آبزی‌پروری است (تیان و همکاران، 2014). از آن‌جایی‌که در بروز صفات و خصوصیات اقتصادی عوامل محیطی نیز موثرند لذا شناسایی ژن‌های مرتبط با آن‌ها، برای ایجاد تغییرات مهم اقتصادی و تسریع اصلاح صفات و انتخاب مستقیم موجودات برای این گونه صفات ضروری است. امروزه روش‌های ژنتیک مولکولی به کشف ژن‌های بزرگ اثر که روی برخی صفات کمی مهم موثر هستند، کمک زیادی کرده است (QTL [9] و مارکرهای ژنتیکی که با QTL پیوستگی دارند). با توجه به شناخت، از نقش و عملکرد این ژن‌ها، انتخاب بر اساس داده‌های مولکولی بر این فرض استوار است که همه افرادی که برای ژن‌های بزرگ اثر تعیین ژنوتیپ شده‌اند، قبل از سن انتخاب قرار دارند. چنانچه هدف فقط انتخاب بر اساس ژن بزرگ اثر باشد در صورتی که مشخص شود یک آلل نسبت به آلل دیگر ارجعیت دارد و افرادی که ترجیحا دو آلل و یا یک آلل ارجع را دارند انتخاب شوند با حداکثر سرعت ممکن منجر به ثبوت آلل های فوق در جامعه خواهد شد. البته این سرعت وابسته به فراوانی ژن‌ها و فشار حاصل از انتخاب خواهد بود. در حالت انتخاب بر اساس ژنوتیپ، فراوانی ژن مورد نظر با سرعت بالایی افزایش می‌یابد و در نهایت ثابت باقی می‌ماند (موری، 2000). در ماهی تعدادی از ژن‌های موثر بر رشد شامل PIT1 [10]، IGF، GHRH [11]، GHR و GH شناسایی شده‌اند.هدف از این پژوهش بررسی ارتباط چند شکلی‌های ژن هورمون رشد (GH) با صفات رشد در دو گونه کپور معمولی و ماهی سفید دریای خزر بوده است.
[1] Deoxyribonucleic Acid [4] Cyprinidae [5] Growth hormone [6] Insulin-like growth factor-1 5 Growth hormone receptor
[8] Single strand conformation polymorphism [9] Quantitative trait loci [10] Pituitary- specific positive transcription factor 1 [11] Growth hormone-releasing hormone
جهت کپی مطلب از ctrl+A استفاده نمایید نماید |
